利用顯微鏡推動(dòng)發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、衰老和神經(jīng)科學(xué)與elegans（線蟲）的發(fā)展

本指南概述了可以高效進(jìn)行線蟲研究的顯微鏡技術(shù)。線蟲是一種廣泛使用的模式生物，與人類有大約70%的基因同源性，是研究發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)、遺傳學(xué)和衰老的理想生物。它的透明性和易培育性使其成為一個(gè)出色的遺傳學(xué)模型系統(tǒng)。它可以進(jìn)行高分辨率成像。主要的實(shí)驗(yàn)方法包括揀蟲、轉(zhuǎn)基因、熒光篩選、成像和記錄。

顯微鏡和線蟲研究

顯微鏡是研究線蟲的工具。在這些步驟中都會(huì)用到它們：

1、“揀蟲"：用金屬挑針從瓊脂平板上挑出蟲子，轉(zhuǎn)移到新的平板上進(jìn)行培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。

2、通過(guò)向線蟲體內(nèi)顯微注射核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)基因（基因改造）。

3、熒光篩選，鑒定表達(dá)轉(zhuǎn)染熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲。

4、在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)線蟲（從胚胎到成蟲的所有階段）進(jìn)行成像和記錄。

這些任務(wù)通過(guò)體視顯微鏡、復(fù)合顯微鏡或共聚焦顯微鏡來(lái)完成。

來(lái)自秀麗隱桿線蟲的細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白SPD5-GFP（指示中心體標(biāo)記，綠色）和Histon 2B-Cherry（指示細(xì)胞核，紅色）。間期細(xì)胞中的兩對(duì)中心體用白色箭頭標(biāo)出。該圖像是經(jīng)過(guò)ICC（即時(shí)計(jì)算去噪）和SVCC（小體積計(jì)算去噪）處理后的Z-stack的最大投影。

揀蟲

要“挑選"具有適當(dāng)表型或轉(zhuǎn)基因的個(gè)體秀麗隱桿線蟲，或?qū)⒕€蟲從一個(gè)平板移到另一個(gè)平板，研究人員需要使用立體顯微鏡和一個(gè)末端帶有金屬的小工具。

與揀蟲有關(guān)的挑戰(zhàn)有：

1. 對(duì)比度不夠好時(shí)，難以識(shí)別線蟲的關(guān)鍵解剖細(xì)節(jié)。

2. 長(zhǎng)時(shí)間揀蟲會(huì)造成用戶疲勞。

3. 用工具處理線蟲時(shí)，顯微鏡物鏡下沒有足夠的空間。

4. 視野不夠大時(shí)，找蟲子很麻煩。

不過(guò)，徠卡顯微鏡具有以下優(yōu)勢(shì)，可以克服這些挑戰(zhàn)：

1. 配備各種對(duì)比方法的透射光底座可實(shí)現(xiàn)高光學(xué)對(duì)比度，從而觀察到蟲體細(xì)節(jié)。

2. 采用人體工程學(xué)模塊，用戶安裝舒適，減少勞累和疲勞。

3. 物鏡下方空間充足，工作距離可達(dá)122毫米。

4. 視野更大，更容易發(fā)現(xiàn)線蟲。

瓊脂板上有很多秀麗隱桿線蟲，就像在挑蟲時(shí)可能會(huì)看到的那樣。

顯微注射轉(zhuǎn)基因

秀麗隱桿線蟲的轉(zhuǎn)基因通常是通過(guò)核酸顯微注射完成的。顯微注射通常使用配有注射裝置的倒置復(fù)合顯微鏡進(jìn)行。

對(duì)線蟲進(jìn)行顯微注射面臨著一些挑戰(zhàn)：

1. 對(duì)比度不足，無(wú)法觀察到線蟲的精細(xì)解剖細(xì)節(jié)，而這正是進(jìn)行適當(dāng)靶向定位所必需的。

2. 沒有足夠的空間使用微型注射器。

3. 設(shè)置不穩(wěn)定時(shí)振動(dòng)太大。

為了克服這些挑戰(zhàn)，用戶可以利用徠卡顯微鏡提供的優(yōu)勢(shì)：

1. 光學(xué)對(duì)比方法，如DIC（微分干涉對(duì)比）或IMC（集成調(diào)制對(duì)比），可清楚地看到注入線蟲的位置。

2. 抗震裝置（防震裝置）穩(wěn)定可靠。

能夠使用精確的操作器（Narishige或Eppendorf）進(jìn)行微量注射。

3. 表達(dá)GFP（綠色熒光蛋白）的轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲。Thunder的圖像由中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的L. Ma提供。

熒光篩選

要找到轉(zhuǎn)基因成功的秀麗隱桿線蟲，需要使用立體顯微鏡進(jìn)行熒光篩選。

線蟲熒光篩選存在一定的挑戰(zhàn)：

1. 熒光信號(hào)暗淡，難以觀察熒光轉(zhuǎn)基因。

2. 老線蟲蟲和瓊脂發(fā)出強(qiáng)烈的自發(fā)熒光。

3. 由于視野較小，難以發(fā)現(xiàn)線蟲，導(dǎo)致篩查時(shí)間延長(zhǎng)。

使用徠卡顯微鏡可以通過(guò)以下方式克服這些篩選難題：

1. 采用三光束技術(shù)的獨(dú)立激發(fā)通道提高了信噪比，適用于體視顯微鏡。

2. 使用專門設(shè)計(jì)的反射鏡防止自發(fā)熒光，反射鏡可與Leica透射光底座一起使用。

3. 徠卡透射光底座提供大視場(chǎng)和多種對(duì)比方法。

一張成年雌雄同體秀麗隱桿線蟲的Thunder拍攝的圖像，展示了其性腺。該線蟲用以下熒光染料進(jìn)行了染色：DAPI（藍(lán)色）指示細(xì)胞核，SP56（綠色）指示精子，RME-2（紅色）指示卵母細(xì)胞，PGL-1（洋紅色）指示RNA和蛋白質(zhì)顆粒。圖片由德國(guó)哈勒馬丁路德大學(xué)的C. Eckmann提供。

成像和文件

在篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲標(biāo)本后，高分辨率成像和精確記錄對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，需要顯微鏡配備高質(zhì)量的攝像頭或探測(cè)器以及兼容的成像軟件。

線蟲成像和記錄方面的主要挑戰(zhàn)是：

1. 由于光散射的原因，在對(duì)線蟲更深處的結(jié)構(gòu)成像時(shí)會(huì)出現(xiàn)焦外模糊的現(xiàn)象。

2. 避免光和熱對(duì)線蟲造成傷害。

3. 利用基因編碼報(bào)告器觀察活體線蟲的暗淡熒光（包括延時(shí)成像）。

使用徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。優(yōu)勢(shì)如下：

1. 利用圖像增強(qiáng)功能，將線蟲深處的細(xì)節(jié)可視化。

2. 使用高質(zhì)量的光學(xué)元件、適當(dāng)?shù)恼彰鞴庠春挽`敏的相機(jī)/探測(cè)器，減少光照射，降低對(duì)線蟲的傷害。

3. 利用寬場(chǎng)顯微鏡和高靈敏度顯微攝像機(jī)的良好單噪比，促進(jìn)實(shí)時(shí)成像。

4. 必要時(shí)，使用轉(zhuǎn)盤、共聚焦或光片顯微鏡獲取更高分辨率的三維圖像。

研究秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)：使用徠卡共聚焦顯微鏡拍攝的表達(dá)熒光蛋白CFP（青色）、GFP（綠色）、YFP（黃色）和DsRed（紅色）的線蟲圖像。

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