隨著光學(xué)技術(shù)的日益普及，越來越多的研究者將其應(yīng)用到了與人類健康密切相關(guān)的領(lǐng)域，但傳統(tǒng)的共聚焦成像已經(jīng)不能滿足需求，科學(xué)家們希望在更精細(xì)的維度深入探索人類疾病的發(fā)展進(jìn)程，了解病原體和宿主的相互作用，以及追蹤長(zhǎng)時(shí)間的生物學(xué)過程。

LIGHTNING 顯著提升共聚焦分辨率和信噪比？

我們有圖，

你有真像！

今天給大家分享的是非常適合上述應(yīng)用的基于徠卡 SP8 共聚焦顯微鏡平臺(tái)的LIGHTNING 超高分辨率的一些成像實(shí)例。關(guān)注我們公眾號(hào)的各位想必從之前的推送中已經(jīng)了解 LIGHTNING 的原理和特點(diǎn)了，它結(jié)合高靈敏度的檢測(cè)器、創(chuàng)新的電子元件以及智能化的圖像信息提取技術(shù)，能為研究者提供超越共聚焦分辨率、突破光學(xué)衍射極限的超高分辨率圖像。

圖 1 為 4 色標(biāo)記的 Cos-7 細(xì)胞在普通共聚焦顯微鏡下（左）和 SP8 LIGHTNING 下（右）的成像結(jié)果。在 LIGHTING 圖像中，我們可以清晰辨別細(xì)胞核（藍(lán)色）、線粒體（綠色）、微絲（灰色）和微管（紅色）的邊緣形態(tài)，即使縱橫交錯(cuò)的細(xì)胞骨架仍能被清楚識(shí)別。因此，整體圖像具有更好的對(duì)比度，為后期圖像分析的準(zhǔn)確度奠定了基礎(chǔ)。

▲圖 1. Cos-7 cells. Cyan: Nucleus, DAPI. Green: Mitochondria, TOM20 Oregon green. Red: Tubulin, TMR. Gray: Actin, SiR. Courtesy of Urs Ziegler, Jana Döhner, Center for Microscopy and Image Analysis (UZH), University of Zürich, Switzerland

美國(guó) Hopkins 醫(yī)學(xué)院的 Holland 實(shí)驗(yàn)室致力于研究控制精確染色體分布的分子機(jī)制以及線粒體錯(cuò)誤在人類健康和疾病中的作用，視頻 1 和圖 2 是該實(shí)驗(yàn)室連續(xù) 12 小時(shí)拍攝的分裂中的 RPE 細(xì)胞，青色為 eGFP-微管蛋白，紫色為 mRFP-組蛋白，可以發(fā)現(xiàn)，即使長(zhǎng)時(shí)間成像，熒光信號(hào)仍然強(qiáng)烈。因此，SP8 LIGHTNING 特別適合超高分辨率的活細(xì)胞觀察。

▲視頻 1.RPE 細(xì)胞分裂時(shí)間序列成像

▲圖 2.12 h confocal time-lapse video of dividing RPE cells stably expressing eGFP-tubulin (cyan) and mRFP-Histidine H2B (magenta). Courtesy of C. Gliech, Holland Labs, John Hopkins School of Medicine, US

西班牙 Carlos III 國(guó)家心血管研究中心（CNIC）是世界有名的心血管研究機(jī)構(gòu)，專注于心血管方向的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用轉(zhuǎn)化，如心血管藥物的開發(fā)。

圖 3 為該研究中心科學(xué)家拍攝的小鼠胚胎心臟超高分辨率圖像，藍(lán)色為血管，紅色為淋巴管壁膜，淋巴管細(xì)胞核為綠色。通過對(duì)大器官級(jí)別的大尺度、多色、超高分辨率成像，科學(xué)家能夠輕松觀察并研究心臟淋巴系統(tǒng)的發(fā)育情況。可見 LIGHTING 能夠輕松勝任器官、組織水平的多色和大范圍超高分辨率的前沿要求。

▲圖 3.Dorsal view of a mouse embryonic heart. Blue: Blood vessels, SMAcy3. Red: Membrane lymphatic vessel wall, Lyve1 633. Green: Nuclear lymphatic vessel, Prox1 cy5.5. Scale bar is 500 µm. Courtesy of Ghislaine Lioux etc., Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Madrid, Spain

圖 4 是小鼠小腸切片，左右分別為共聚焦和 LIGHTNING 圖像。從 LIGHTNING 圖像上能看到更為清晰的杯狀細(xì)胞分泌的 WGA 粘液（黑白）、細(xì)胞核（綠色）以及刷狀緣（紅色）。可見 LIGHTNING 不僅提升了分辨率和信噪比，還保留了所有熒光分子的信息。

▲圖 4.FluoCells mouse intestine section. B&W Alexa Fluor 350 WGA mucus of goblet cells, Green SYTOX Green Nuclei, Red Alexa Fluor 568 phalloidin filamentous actin (brush border)

圖 5 為草履蟲基體的 LIGHTNING 圖像。采用高速成像，掃描分辨率 2495 x 2495。可見即使在高速掃描的條件下，LIGHTNING 仍然具有*的分辨率和清晰度，*勝任活體樣品的超快超高分辨率成像。

▲圖 5.Paramecium tetraurelia. Basal Body AF 488 (black & white). Imaging using resonant scanner at maximum FOV and format (2495 x 2495). 8 x line averaging. Image width: 100 µm. Sample Courtesy of Anne Aubusson-Fleury. Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), French National Centre for Scientific Research (CNRS), Gif-sur-Yvette, France

圖 6 是小鼠膈肌，左右分別為共聚焦和 LIGHTNING 的 3D 圖像。從右圖可以清晰地看到交感神經(jīng)以及突觸后分布的乙酰膽堿受體的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

▲圖 6.Whole mount mouse diaphragm muscle was stained for nicotinic acetylcholine receptors, a principal postsynaptic component of neuromuscular junctions (red) and tyrosine hydroxylase, a marker for sympathetic neurones (green). Courtesy of Tatjana Straka and Rüdiger Rudolf, University of Applied Science, Germany

從上面的結(jié)果可以看出，SP8 LIGHTNING 在進(jìn)行超高分辨率成像的同時(shí)，還具有很強(qiáng)的提取圖像信息的能力，無論對(duì)于弱熒光信號(hào)的樣品、高速運(yùn)動(dòng)中的樣品、需 3D 成像的厚樣品，都能輕松獲取可用于定量分析的超高清圖像，還可以結(jié)合 Navigator 導(dǎo)航式智能拼圖，進(jìn)行大樣品的超高成像。另外，LIGHTNING 超高分辨率成像技術(shù)還可應(yīng)用于 SP8 DIVE 光譜式多光子、STED 納米顯微鏡，進(jìn)一步提高其成像質(zhì)量！

更多的應(yīng)用實(shí)例，敬請(qǐng)期待。